高压蒸气灭菌法是一种迅速而有效的灭菌方法。使用高压蒸气灭菌器，利用加热产生蒸气，随着蒸气压力不断增加，温度随之升高，通常压力在103.4kPa(相当旧制的15磅/吋 2 或1.05kg/cm 2 )时，器内温度可达121.3℃，维持15～30min，可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。此法常用于一般培养基、生理盐水、手术器械及敷料等耐湿和耐高温物品的灭菌。
高压蒸汽灭菌法的注意事项：
第一，无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。
第二，布类物品应放在金属类物品上，否则蒸汽遇冷凝聚成水珠，使包布受潮。阻碍蒸汽进入包裹中央，严重影响灭菌效果。
第三，定期检查灭菌效果。经高压蒸汽灭菌的无菌包、无菌容器有效期以1周为宜。高压蒸汽灭菌效果的监测：有以下三种方法。
第一种是工艺监测，又称程序监测。根据安装在灭菌器上的量器（压力表、温度表、计时表）、图表、指示针、报警器等，指示灭菌设备工作正常与否。此法能迅速指出灭菌器的故障，但不能确定待灭菌物品是否达到灭菌要求。此法作为常规监测方法，每次灭菌均应进行。
第二种是化学指示监测。利用化学指示剂在一定温度与作用时间条件下受热变色或变形的特点，以判断是否达到灭菌所需参数。常用的有：
自制测温管：将某些化学药物的晶体密封于小玻璃管内（长2cm,内径1～2mm）制成。常用试剂有苯甲酸（熔点121－123℃）等。灭菌时，当湿度上升至药物的熔点，管内的晶体即熔化，事后，虽冷却再凝固，其外形仍可与未熔化的晶体相区别，此法只能指示温度，不能指示热持续时间是否已达标，因此是最低标准。主要用于各物品包装的中心情况的监测。
3M压力灭菌指示胶带：此胶带上印有斜形白色指示线条图案，是一种贴在待灭菌的无菌包外的特制变色胶纸。其粘贴面可牢固地封闭敷料包、金属盒或玻璃物品，在121℃经20分钟，130℃经4分钟后，胶带100％变色（条纹图案即显现黑色斜条）。3M胶带既可用于物品包装表面情况的监测，又可用于对包装中心情况的监测，还可以代替别针，夹子或带子使用。
第三种是生物指示剂监测。利用耐热的非致病性细菌芽胞作指示菌，以测定热力灭菌的效果。菌种用嗜热脂肪杆菌，本菌芽胞对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽胞相似。生物指示剂有芽胞悬液、芽胞菌片以及菌片与培养基混装的指示管。检测时应使用标准试验包，每个包中心部位置生物指示剂2个，放在灭菌柜室的5个点，即上、中层的中央各一个点，下层的前、中、后各一个点。灭菌后，取出生物指示剂，接种于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，置55－60℃温箱中培养48小时至7天，观察最终结果。若培养后颜色未变，澄清透明，说明芽胞已被杀灭。达到了灭菌要求。若变为黄色混浊，说芽胞未被杀灭，灭菌失败
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