更安全更快速的再生医学策略：利用直接重编程改变细胞身份

在死亡之前，已变成皮肤细胞的细胞仍然是皮肤细胞。在过去十年，明显的是，细胞身份并不是一成不变的，它能够通过激活特异性的遗传程序而得以重写。如今，再生医学领域面临着一个问题：这种重写应当采取常规方法，即成熟细胞首先转化回干细胞，或者如果可行的话，采取一种更加直接的方法？

术语“终末分化（terminally differentiated）”概述了一种旧的观念---皮肤细胞、肌肉细胞或其他的成熟细胞不能够经过诱导而获得一种显著不同的命运。十年前，这种观念开始摇摇欲坠，这是因为那年日本京都大学细胞生物学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）证实导入几个基因能够将成年的成纤维细胞（结缔组织）转化为诱导性多能干细胞（iPS细胞）[1]。类似于胚胎干细胞，iPS细胞能够分化为任何一种类型的细胞，这一性质被称作为多能性。不同于胚胎干细胞---它们必需从人胚胎中收集，因此面临着而巨大的政治负担---的是，iPS细胞也能够无限量地增殖。

仅仅在山中伸弥的发现---这一发现让他赢取2012年诺贝尔生理学或医学奖---几年后，研究人员就已开始发现改变细胞类型的捷径，他们称之为“直接重编程”，即一种类型的成熟细胞经诱导后能够直接变成另一种类型的成熟细胞，而不需要借助产生iPS细胞这一中间阶段。研究人员已了解到如何将皮肤细胞转化为神经元或心脏细胞，如何将胃细胞转化为分泌胰岛素的β细胞。利用直接重编程产生神经元的德国美因兹古藤堡大学科学家Benedikt Berninger说，“就在你的眼前观察这些细胞改变它们的身份是非常神奇的。”

相对于对iPS细胞的研究，对直接重编程的研究还处于更加初始的阶段，但是它正激发人们对再生医学的兴趣。直接重编程的细胞可能比通过iPS细胞中间阶段产生的细胞更加安全，这是因为后者可能含有多能性细胞而具有与肿瘤细胞一样的广泛增殖能力，这会使得它们潜在地导致癌症产生。

基于iPS细胞的临床介入必需谨慎地开展以便确保没有多能性细胞与完全成熟的细胞一起移植。瑞典隆德大学神经生物学家Malin Parmar---希望利用直接重编程逆转帕金森病患者大脑中的神经元丢失---说，“风险就是你可能失去对这些细胞的控制，它们在移植后开始不受控制地增殖。但是，如果你绕过iPS细胞产生阶段，那么它更加快速和潜在地更加安全。”

改变遗传程序

重写细胞身份首先需要理解这些身份是如何建立的。体内的每个细胞都能追踪它的祖先到单个起源：受精卵。当胚胎细胞分裂和成熟时，它们的命运是由发育过程中特异性的基因开启和关闭所确定的。被称作转录因子的蛋白首先结合到基因组中的某些DNA序列，随后激活或抑制附近的基因，从而调节这一过程。控制一种发育中的细胞命运的转录因子经常被称作主调节因子（master regulator），这是因为它们控制复杂的一连串基因活性。

哈佛干细胞研究所细胞生物学家Qiao Zhou说，“这些主调节因子基本上都是根据它们在胚胎发生时产生某些细胞类型中的关键性作用来决定的。一个祖细胞（progenitor cell）可能能够变成细胞A、B或C，但是如果你迫使它表达某种主调节因子，它将不可避免地选择变成细胞A。”

证实主调节因子能够用于直接重编程的早期研究可追溯到1987年，那一年，来自弗雷德-哈金森癌症研究中心的Harold Weintraub、Andrew Lassar和他们的同事们证实诱导成纤维细胞表达某一DNA片段能够让它进入变成肌肉细胞的发育途径；他们随后发现导致这种变化的单个基因编码转录因子MyoD[2]。加州大学旧金山分校格拉斯通心血管疾病研究所心脏发育研究员Deepak Srivastava说，“这在当时是一项颠覆性的发现，也因此这个领域的人们曾认为大多数其他类型的细胞会有一种关键性的转录因子，该因子发挥如此强大的作用而足以改变细胞的命运。”

但是事情并不是这么简单。寻找单个能够启动重编程的主调节因子会导致多年的沮丧，直到山中伸弥揭示出有效重编程的秘密并不是单个因子，而是多种基因的组合。随着研究人员混合和搭配不同的主调节因子组合，成功的故事开始不断涌现。

2008年，哈佛大学科学家Douglas Melton团队（Zhou是该团队的一员）将一种类型的胰腺细胞转化为另一种产生胰岛素的胰腺β细胞，其中β细胞是很多糖尿病患者所需要的。Zhou说，“我们的研究作出结论：你仅需三种主调节因子实现这一点。”2010年，斯坦福大学干细胞科学家Marius Wernig领导的一个团队也利用三种基因将成纤维细胞转化为神经元。对这项研究进一步优化和扩展可产生一系列不同的特化神经元，其中每种神经元产生截然不同的神经递质信号，或者对这些不同的信号作出反应。

迄今为止，大多数开创性的直接重编程发现都是在体外培养的细胞中实现的。但是若能够在体内促进细胞转化的话，很多研究人员就会对再生医学抱有更加大的希望。在一种器官中相对丰富的细胞群体可能能够转化为更加迫切需要的其他类型的成熟细胞。迄今为止，研究人员已在动物实验中取得一些成就。比如，Parmar团队发现通过将携带编码重编程因子的基因的病毒载体注射进小鼠大脑中能够将神经胶质细胞转化为功能性的神经元。Srivastava也类似地在心脏内将小鼠成纤维细胞转化为跳动的心肌细胞，这一策略可能提供一种治疗心脏病发作导致的心脏损伤的方法。他说，“你拥有已经存在于器官中的大量细胞群体，你能够将它们用于再生。”但是，迄今为止，还没有人在人体内尝试过直接重编程。

身份危机

到目前为止，大多数研究着重关注确保重编程过程成功。鉴于一种细胞类型的身份是由多种基因决定的，研究人员不仅不得不成功地找出启动这些基因的主调节因子组合：理想上，他们也不得不发现尽可能#!小的组合。这是因为迫使一种细胞表达主调节基因（master regulator gene）的#!可靠方法是运送这些基因的额外拷贝到这种细胞中，而相比于运送仅仅几种基因，运送很多种基因到细胞中是一种更加困难的技术挑战。找出#!小的主调节基因组合需要一番艰苦跋涉：通常，潜在的组合名单是比较巨大的，#^的筛选方法就是系统性地逐一测试。比如，Parmar团队以12种候选基因开展产生多巴胺的神经元的研究，经过一番筛选后，最终将它缩小到2种基因。

一些研究人员已开始设计专门用于直接重编程的软件，该软件整入关于哪些主调节因子控制组织形成的信息。一个横跨三个大洲的团队已开发出一种被称作Mogrify的实验规划工具，这个工具将来自众多细胞类型的大量基因表达数据与不同主调节因子控制的基因网络方面的规则汇集在一起[4]。基于这些数据和规则，Mogrify可被用来预测将导致所需的细胞身份变化的重编程因子组合。这就为研究人员提供一种方法在计算上鉴定出尽可能#!少的主调节基因组合，这一组合能够将一种特定类型的细胞直接重编程为另一种特定类型的细胞。

但是提供有活性的主调节基因并不足以确保完全的重编程：这些主调节基因可能成功地将细胞设置在一个发育途径上，但是会让它处于一种未成熟的前体细胞状态。因此接下来的任务就是鉴定出其他的哪些基因必须处于活性状态来完成这一发育过程。

中国北京大学干细胞生物学家邓宏魁（Hongkui Deng）教授多年来努力解决这个问题。他刚开始努力通过只诱导主调节基因表达将皮肤细胞直接转化为肝细胞。在第二轮筛选时，他又鉴定出能够完成这种重编程的其他基因[5]。他将它们称为成熟因子（maturation factor），即在启动转化时并不发挥重要作用但在获得功能性的成熟细胞中起着至关重要作用的基因。

其他研究人员已发现他们能够利用在促进重编程的细胞信号通路中发挥作用的化学物扩大主调节基因的效应，从而提高直接重编程的成功效率，有时化学物独自也能够促进细胞类型转换。

即便使用合适的基因和化学衍生物也难以证实一种直接重编程是否是真正完成的。利用显微镜进行观察能够揭示出一种转化是否发生---比如，扁平的星形的成纤维细胞是否形成长长的轴突状突出，但是也需要对细胞的内部运作进行更加深入的分析。简而言之，一个人如何确保皮肤细胞经重编程后是否真正地变成神经元，而不只是神经元类似物？

检测主调控基因的下游活性能够对细胞重编程如何好地成功完成提供深入认识。如果导入的主调控基因确实发挥作用的话，它们应当导致细胞核中的全局基因表达模式发生重大的变化，那么哪种变化应当匹配在靶组织的成熟细胞中发现的表达模式呢？有几种方法研究细胞的全局基因表达，比如，对细胞中的所有RNA分子进行测序。来自波士顿大学和哈佛大学的研究人员已利用这种类型的测序数据开发一种能够评估重编程细胞中的基因活性如何好地匹配靶基因中的基因活性的软件程序CellNet[6]。

然而，真正重要的细胞身份测试是重编程细胞是否在功能上能够替换自然分化的细胞。德州大学西南医学中心神经生物学家Chun-Li Zhang说，“如果它们看起来像是神经元，而且它们的基因表达也类似于神经元，那么这并不意味着它们是真正的神经元。”令人信服的证据需要接受一系列评估，比如利用电生理学测量证实一种新形成的神经元是否放电，因而是否能够激活与它通过突触连接在一起的其他神经元。Zhou说，没有一种特征性的评估方法能够独自地提供足够说服力的证据。他的团队将肝细胞重编程为胰腺β细胞的努力只产生功能异常的中间物。他说，“它们合成和释放大量的胰岛素---如此之多以至于动物死于低血糖症。”这是因为它们缺乏胰腺细胞检测血糖水平并对它作出反应的能力。

这些测试的一大发现是在靶器官内促进细胞重编程通常要比在体外培养的细胞中表现得更好。Srivastava说，“当在塑料材料上时，我们细胞中的大多数经过重编程后只是部分地变成心肌细胞。但是在它们的天然环境中，它们中的绝大多数进入跳动的状态，并且与它们的周围细胞在电学上偶联在一起。”这可能是因为器官中的其他周围细胞产生的化学信号，或者是因为在三维组织环境中的特征很难在实验室中再现。无论出于何种原因，它很好地预示着临床应用开发。

通往临床应用之路

研究人员同意在这些方法能够在人体内测试之前，还有很多障碍要克服。一般而言，已证实相比于小鼠细胞，人细胞在进行直接重编程时更加充满挑战：它们倾向于花费更长时间经历这个重编程过程，而且虽然一些转录因子足以在动物实验中实现直接重编程，但是人细胞经常需要额外的转录因子。

基因转运也带来巨大的挑战，特别是将基因转运进大脑等器官中。在一些情形下，偏好感染特定细胞类型的病毒能够有助引导重编程因子进入特定的患病或损伤位点，但是运送到不需要的位点可能仍然会带来风险。

不过，还会存在拆了东墙补西墙的问题。在大脑中，将神经胶质细胞转化为神经元会降低那里的神经胶质细胞数量，而这本身可能就产生风险。Berninger说，“这些细胞不是装饰门面。它们也发挥重要的功能，但是如果我们把它们拿走了，我们该如何替换它们呢？”一种可能性就是细胞在经重编程后进入一种增殖性的---但非致瘤性的---神经祖细胞（neural progenitor）状态。那样的话，一些神经胶质细胞可能能够产生大量的神经元。

心脏治疗很可能#!接近于临床应用。Srivastava团队已开始研究将猪心脏内的成纤维细胞转化为心肌细胞。他说，“我们有初步的概念验证：即便在像我们这样的大的心脏中，我们也能够实现转化的效果。”如今，这个团队正在开展安全性研究，而且正在优化他们的基因运送方法，以便实现获得监管部门批准用于人体临床试验的目标。重要的是，心脏成纤维细胞能够自我补充，因此对细胞丢失的担忧并不那么严重。

Zhou团队努力将体外培养的人胃肠道细胞直接转化为β细胞，并且也正在努力在诊所中开展应用。这些肠道细胞很容易通过活组织检查获得，而且在体外培养和重编程后，在理论上，它们能够移植到患有糖尿病的志愿者的胰腺中。

直接重编程正开始获得产业界的关注，不过生物技术公司和制药公司并没有准备好全心全意地投入其中。尽管从某种意义上说，对iPS细胞和胚胎干细胞的研究有先行一步的优势，但是随着细胞类型直接转化的优势日益突出，这一差距可能会被填平。Zhou说，“迄今为止，还没有同等数量的资源和人力投入到这种方法中。但是这个领域正在快速赶上，我迫不及待地想看到它将会如何发展。”